Подбор генов-мишеней для диагностики штаммов Xanthomonas arboricola (Vauterin et al. 1995), патогенных для злаковых и капустных культур

Группа бактерий рода Xanthomonas, вирулентных для пшеницы, ржи, ячменя, томата, подсолнечника и капустных культур, была выделена в России в 2001-2008 гг. Анализ физиологических признаков и мультилокусное секвенирование (Multi Locus Sequence Typing - MLST) показали принадлежность бактерий к виду X. arboricola. Сравнение генома представительного для данной группы штамма 3004, выделенного из ячменя, но также вирулентного для подсолнечника, китайской капусты и грецкого ореха, продемонстрировало отсутствие следов транспортной системы третьего типа (T3SS) и горизонтальный перенос (ГП) ряда других генов вирулентности из отдаленно-родственных видов. Выдвинута гипотеза, что гены транспортной системы четвертого типа (T4SS), включая virE, полученные благодаря ГП, определили широкий круг поражаемых этими штаммами растений. Было предложено использовать гены T4SS в качестве мишени для группа-специфичного анализа этих патогенных штаммов. После проверки, проба для TaqMan(R) ПЦР в реальном времени была разработана для 121 п.о. фрагмента гена virD4. Продукты амплификации были получены для всех штаммов X. arboricola и не обнаружены у бактерий других видов ксантомонад и эпифитных бактерий, присутствующих на растениях-хозяевах. Разработанный диагностикум позволяет определять целевую группу X. arboricola на пораженных растениях при прямом ПЦР или после периода роста на селективной питательной среде (био-ПЦР), и имеет чувствительность выше, чем у традиционного метода выделения бактерий на селективной питательной среде.

Plant pathogenic xanthomonads virulent to wheat, rye, barley, tomato, sunflower, and brassicas were isolated in Russia in 2001-2008. Physiological tests and multilocus sequence typing analysis confirmed their position within the Xanthomonas arboricola species. The obtained draft genome sequence of representative strain 3004 from barley plants, which is also virulent to sunflower, brassicas, and chestnut, demonstrated an absence of the Type 3 Secretion System T3SS and an evidence for the lateral gene transfer of some other virulence genes from distantly related bacteria. It was concluded that T4SS genes can be used as the target for group-specific PCR analysis of the emerging pathogen. It was proposed to use virD4, virB3, virB4, and virB9 genes to design a detection system. After preliminary experiments with classic PCR for the chosen genes, primers and TaqMan(R) probe were designed to specifically amplify a 121 bp fragment of the VirD4 gene. Amplification products were obtained for all target Xanthomonas arboricola strains and were not detected in other Xanthomonas species, or in other pathogenic or epiphytic bacteria occurring on these host plants. The assay readily detected Xanthomonas arboricola infection in diseased plants and from bacterial colonies isolated on semi-selective media, and was more sensitive and specific than traditional plating methods.