ИЗУЧЕНИЕ СТОХАСТИЧЕСКОЙ УПАКОВКИ БЕЛКОВ Cas В ЭКЗОСОМЫ

Системы CRISPR/Cas являются перспективными молекулярными инструментами для направленных манипуляций с генетическим материалом, включая редактирование генома, регуляцию транскрипции генов, модификацию эпигенома. Несмотря на высокую эффективность и возможность использования систем CRISPR/Cas при различных наследственных, инфекционных и онкологических заболеваниях, отсутствие эффективных методов упаковки и доставки этих систем in vivo препятствует их внедрению в клиническую практику. Современные платформы для доставки генетических конструкций на основе синтетических наночастиц органической и неорганической природы имеют ряд ограничений, а именно низкую эффективность упаковки, иммуногенность, токсичность, отсутствие тропности, сложный и дорогой процесс производства. Экзосомы, секретируемые клетками эукариот, представляют собой биологические наночастицы, которые обладают высочайшей биосовместимостью, физико-химической стабильностью и способностью преодолевать биологические барьеры. Безопасность использования экзосом подтверждена в многочисленных клинических исследованиях. В последние годы экзосомы рассматриваются как перспективные носители для доставки систем CRISPR/Cas in vivo. В представленной работе на различных линиях клеток определена эффективность стохастической упаковки систем CRISPR/Cas в экзосомы. Показано, что белок Cas9 локализуется в компартменте биогенеза экзосом, однако стохастическая упаковка Cas9 в экзосомы обеспечивает попадание белка Cas9 всего в ~1% целевых клеток. Низкая эффективность стохастической упаковки белка Cas9 не позволяет использовать этот метод в генетическом редактировании. Следовательно, необходимы новые методы и технологии загрузки CRISPR/Cas-систем в экзосомы.

CRISPR/Cas systems are perspective molecular tools for targeted manipulation with genetic materials, including gene editing, regulation of gene transcription, modi cation of epigenome etc. While CRISPR/Cas systems proved to be highly effective for correcting genetic disorders and treating infectious diseases and cancers in experimental settings, the clinical translation of these results is hampered by the lack of efficient CRISPR/Cas delivery vehicles. Modern synthetic nanovehicles based on organic and inorganic polymers have many disadvantages, including toxicity issues, the lack of targeted delivery, complex and expensive production pipelines. In turn, exosomes are secreted biological nanoparticles exhibiting high biocompatibility, physico-chemical stability, and ability to cross biological barriers. Early clinical trials found no toxicity associated with exosome injections. In recent years, exosomes have been considered as perspective delivery vehicles for CRISPR/Cas systems in vivo. The aim of this study was to analyze the efficacy of CRISPR/Cas stochastic packaging into exosomes at several human cell lines. Here, we show that Cas9 protein is effectively localized into the compartment of intracellular exosome biogenesis, but stochastic packaging of Cas9 into exosomes turns to be very low (~1%). As such, stochastic packaging of Cas9 protein is very ineffective, and cannot be used for gene editing purposes. Developing novel tools and technologies for loading CRISPR/Cas systems into exosomes is required.