Определение антител против шиповидного белка SARS-CoV-2 в сыворотке вакцинированных добровольцев методом проточной цитометрии

Введение. Определение антител против шиповидного (Spike, S) белка нового корона-вируса SARS-CoV-2 широко используется для подтверждения текущей или перенесенной инфекции SARS-CoV-2, а также в качестве показателя эффективности вакцинации против COVID-19. Наиболее распространенным методом определения анти-S-антител является иммуноферментный анализ (ELISA), в котором используется рекомбинантный S-белок. Метод иммунофлуоресценции с последующей проточной цитометрией предоставляет альтернативную возможность для определения анти-S-антител, где в качестве S-антигена используется белок в нативной трансмембранной конформации. Цель исследования - отработка метода определения анти-S-антител с помощью проточной цитометрии, а также подбор наиболее адекватного метода обработки экспериментальных данных. Материал и методы. В исследовании приняли участие 22 добровольца (7 мужчин и 15 женщин от 25 до 70 лет, медиана - 48 лет). Все добровольцы с января по февраль 2021 г. были вакцинированы двумя дозами вакцины «Спутник V». Образцы сывороток доноров были собраны до вакцинации «Спутником V» и через 3 мес после вакцинации. 5 добровольцев к моменту вакцинации уже переболели COVID-19 в легкой форме. Остальные 17 добровольцев до вакцинации не встречались с антигеном SARS-CoV-2. Антитела против S-белка определяли методом иммунофлуоресценции с регистрацией на проточном цитометре. В качестве мишеней использовали клетки HEK293, временно трансфецированные плазмидой, кодирующей S-белок дикого типа. Трансфекцию проводили кальций-фосфатным методом. Клетки обрабатывали последовательно разведенными сыворотками, а затем окрашивали вторичными антителами анти-IgG-FE и анти-IgM-FITC. Уровень флуоресценции измеряли с помощью проточного цитометра. В качестве результата измерения использовали среднее значение флуоресценции (mean fluorescence intensity, MFI), полученное при разведении сыворотки в 18 раз, или площадь под кривой титрования (area under curve, AUC). Анти-RBD-антитела определяли с помощью иммуноферментного анализа, а вирус-нейтрализующую активность - с помощью псевдотипированного или суррогатного вирус-нейтрализационного анализа (pVNA и sVNA). Результаты. С помощью отработанного метода было показано образование анти-S-антител изотипов IgG и IgM через 3 мес после иммунизации вакциной «Спутник V». В упрощенном варианте метода относительную концентрацию антител определяли при единственном разведении тестируемой сыворотки путем измерения средней интенсивности флуоресценции (MFI) клеток-мишеней. Более надежные результаты были получены при регистрации кривой титрования и подсчета площади под кривой (AUC). Полученные таким образом результаты хорошо коррелировали с определением анти-RBD-антител методом ELISA, а также с данными вирус-нейтрализации в псевдотипиро-ванном и суррогатном вариантах. Заключение. Проточная цитометрия - это удобный метод для одновременного определения в сыворотке человека анти-S-антител изотипов IgG и IgM. К преимуществам метода относится то, что S-белок представляется в нативной трансмембранной конформации. После незначительной модификации отработанный метод можно использовать для определения уровня анти-S-антител против мутантных вариантов SARS-CoV-2.

Introduction. The determination of antibodies against the Spike (S) protein of the novel coronavirus is widely used to confirm current or past infection with SARS-CoV-2, and as an indicator of the effectiveness of vaccination against COVID-19. The most common method for detecting anti-S-antibodies is enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which uses a recombinant S-protein. Immunofluorescence followed by flow cytometry provides an alternative approach to detect anti-S-antibodies, where a protein in the native transmembrane conformation is used as the S-antigen. The aim of the study was to develop a method for determining anti-S-antibodies using flow cytometry, and to select the most appropriate method for processing experimental data. Material and methods. The study involved 22 volunteers (7 men and 15 women aged 25 to 70 years, median 48). All volunteers were vaccinated with two doses of the «Sputnik V» vaccine between January and February 2021. Donor sera samples were collected before vaccination with «Sputnik V» and 3 months after vaccination. 5 volunteers had already had a mild form of COVID-19 before the time of vaccination. The remaining 17 volunteers did not encounter the SARS-CoV-2. Antibodies against S-protein were determined by immunofluorescence with registration on a flow cytometer. HEK293 cells were transiently transfected with a plasmid encoding the wild type S-protein which was used as target. Transfection was performed by the calcium phosphate method. Cells were incubated with serially diluted sera and then stained with anti-IgG-PE and anti-IgM-FITC secondary antibodies. The fluorescence level was measured using a flow cytometer. As a measurement result, the mean fluorescence intensity (MFI) obtained at 1:18 serum dilution, or the area under the titration curve (area under curve, AUC) was used. Anti-RBD-antibodies were determined using enzyme immunoassay, and virus-neutralizing activity using pseudotyped or surrogate virus-neutralization analysis (pVNA and sVNA). Results. Using the developed method, the formation of anti-S antibodies of the IgG and IgM isotypes was shown 3 months after immunization with the «Sputnik V» vaccine. In a simplified version of the method, the relative concentration of antibodies was determined at a single dilution of the test serum by measuring the mean fluorescence intensity (MFI) of the target cells. More reliable results were obtained by construction the titration curve and calculating the area under the curve (AUC). The results thus obtained correlated well with the detection of anti-RBD antibodies by ELISA, as well as with virus neutralization data in pseudotyped and surrogate assays. Conclusion. Flow cytometry is a convenient method for the simultaneous determination of anti-S antibodies of IgG and IgM isotypes in human serum. The advantages of the method include the fact that the S-protein is presented in a native transmembrane conformation. After minor modification, the established method can be used to determine the level of anti-S-anti-bodies against mutant variants of SARS-CoV-2.