Применение новых методов выявления и идентификации Acidovorax Citrulli и оптимизация схемы лабораторной диагностики

Фитопатогенная бактерия Acidovorax citrulli входит в карантинные перечни многих стран мира, в том числе в Единый перечень карантинных объектов Евразийского экономического союза. Контроль проникновения и распространения карантинного организма на территорию России осуществляется, в том числе, путем проведения лабораторной диагностики. Диагностические методы должны обеспечивать не только качество, но и высокую скорость проведения тестирования здоровья продукции. Целью исследований стало применение новых методов выявления и идентификации A. citrulli, а также оптимизация схемы лабораторной диагностики. В ходе работы подготавливали и тестировали семена огурца с инфекционной нагрузкой. Тестирование проводили согласно оптимизированной диагностической схеме с применением не использовавшихся ранее в диагностике A. citrulli методов. На каждом этапе работы с образцами проводили учет затрачиваемого времени. Тестирование подготовленных зараженных семян на первом этапе проводили стандартным отборочным методом, а затем - ранее не применявшимся в диагностике A. citrulli методом ПЦР-РВ PAS F/R, PAS P Новый тест ПЦР-РВ PAS F/R, PAS P показал стабильные результаты при тестировании каждого образца в ряду каждой повторности. Успешно применен ранее не использовавшийся в диагностике A. citrulli метод обогащения образца. Использование метода позволило в течение 2,5 сут. отделить образцы, в которых содержится живая целевая бактерия, от тех образцов, в которых присутствовала только ДНК A. citrulli. Успешно проведены изоляция и идентификации культуры A. citrulli из образцов после обогащения. На основании данных, полученных в результате исследований, оптимизирована схема выявления и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli. Предлагаемая схема позволит сократить время проведения диагностики опасного карантинного организма с четырех недель до одной.

The phytopathogenic bacterium Acidovorax citrulli is included in the quarantine lists of many countries, including the unified list of quarantine objects of the Eurasian Economic Union. The control of the introduction and spread of the quarantine organism into the territory of Russia is carried out through laboratory diagnostics. Diagnostic methods should ensure quality and the high speed of product health testing. The study aimed to use new methods for the detection and identification of A. citrulli and to optimize the laboratory diagnostic scheme. In the course of the work, cucumber seeds with an infectious load were prepared and tested. Testing was carried out according to an optimized diagnostic scheme using methods not previously used to diagnose A. citrulli. At each stage of work with samples, the time spent was recorded. The researchers tested the prepared infected seeds at the first stage using the standard qPCR method and then the qPCR method PAS F/R, PAS P which had not previously been used to diagnose A. citrulli. The new qPCR test PAS F/R, PAS P showed stable results at testing each sample in a row of each replication. The sample enrichment method was successfully applied, not previously used in diagnosing A. citrulli. The use of the method made it possible to separate samples containing live target bacteria from those containing only A. citrulli DNA within 2.5 days. After enrichment, the isolation and identification of the A. citrulli culture from the samples were successfully carried out. Based on the data obtained as a result of this study, the scheme for detecting and identifying the causative agent of bacterial fruit blotch of cucurbits was optimized. The proposed scheme will reduce diagnosing a dangerous quarantine organism from four weeks to one week.