ДЕТЕКЦИЯ COLLETOTRICHUM COCCODES С ПОМОЩЬЮ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

Фитопатогенный гриб Colletotrichum coccodes вызывает опасные заболевания картофеля и томата, известные как антракноз и черная пятнистость клубней. По морфологическим признакам их часто трудно отличить от заболеваний, вызываемых другими микроорганизмами; на зеленых плодах томата болезнь может протекать бессимптомно, проявляясь только на созревших красных плодах. Для быстрой и точной диагностики возбудителя предлагается тест-система для ПЦР в реальном времени. Для разработки тест-системы была определена последовательность нуклеотидов гена глицеролтрифосфатдегидрогеназы 45 штаммов C. coccodes, выделенных из клубней картофеля в разных регионах России. На основании полученных результатов и анализа аналогичных последовательностей других видов, имеющихся в базе данных GenBank, были сконструированы видоспецифичные для C. coccodes праймеры и зонд. Для проверки специфичности созданной тест-системы проводили ПЦР с ДНК, выделенной из чистых культур 15 различных видов паразитических и сапротрофных грибов, ассоциированных с растениями томата и картофеля (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternatа, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Присутствие ДНК Colletotrichum coccodes определялось при пороговом цикле 20–27, тогда как остальные виды определялись после 40 циклов или не детектировались. Тест-система позволяет уверенно детектировать в анализируемой ПЦР-смеси концентрации ДНК C. coccodes, превышающие 0.01 нг/мм³. С помощью разработанной тест-системы было исследовано присутствие C. coccodes в листьях томата с симптомами поражения грибными болезнями и в клубнях картофеля без внешних симптомов заболевания. Листья с симптомами грибного поражения были собраны с двух разных полей в Краснодарском крае, клубни – с полей в Костромской, Московской, Калужской, Нижегородской областях. В Краснодарском крае был обнаружен один лист томата, содержащий ДНК C. coccodes; достоверное присутствие ДНК этого патогена было выявлено в 5 образцах клубней, выращенных в Костромской, Московской, Калужской областях.

Detection of Colletotrichum coccodes by Real-Time PCR

Colletotrichum coccodes causes dangerous diseases of potato and tomato, known as Anthracnose and Black Spot. Morphologically, they are often difficult to distinguish from diseases caused by other microorganisms. On the green tomato fruits disease may be asymptomatic. It appears only on ripe red fruits. For quick and accurate diagnosis and identification of the pathogen a test system for real-time PCR is proposed. To develop a test system the nucleotide sequence of the glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene was determined in 4 different strains of C. coccodes. Based on the results obtained and the analysis of similar sequences of other species available in the GenBank Database, the C. coccodes species-specific primers and probe were designed. To test the specificity of the created test system, PCR was performed with DNA isolated from pure cultures of 15 different types of parasitic and saprotrophic fungi associated with tomato and potato plants (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternatа, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). The presence of Colletotrichum coccodes DNA was determined at a 20–27 threshold cycle. The remaining types of fungi were determined after 40 cycles or were not detected at all. The test system allows confidently detect in the analyzed PCR-mixture concentrations of C. coccodes exceeding 0.01 ng/mm³. Using the test system created was investigated the presence of C. coccodes in tomato leaves with symptoms of fungal diseases and potato tubers without external symptoms of the disease. Leaves with fungal lesion symptoms were collected from 2 different fields in the Krasnodar region, tubers – from the fields in the Kostroma, Moscow, Kaluga, Nizhny Novgorod regions. A single leaf of tomato containing C. coccodes DNA was found while the presence of C. coccodes DNA tubers grown in the Kostroma, Moscow and Kaluga regions was detected in 5 samples.