Экспериментальное перепрограммирование in vitro в модели вирусно-бактериальной коинфекции фенотипа субпопуляций CD64-CD32+CD16+CD11b+НГ, CD64+CD32+CD16+CD11b+НГ нейтрофильных гранулоцитов под влиянием аргинил-альфа-аспартиллизил-валил-тирозил-аргинина

Одной их ключевых причин негативного полимикробного синергизма при коинфекциях является нарушение функционирования нейтрофильных гранулоцитов (НГ). В этой связи актуальность приобретает разработка в системе in vitro экспериментальных моделей вирусно-бактериальных коинфекций, в которых возможно на молекулярном уровне выявить дефекты включения НГ в эффекторные процессы и оценить реорганизацию взаимосвязанных функционально-значимых рецепторов НГ под влиянием различных иммунотропных веществ. Понимание молекулярных механизмов работы той или иной молекулы, включая «молекулу» лекарственного препарата, обеспечивает безопасное его применение и делает его препаратом выбора. Функциональная активность НГ связана с поверхностными мембранными рецепторами CD64, CD32, CD16, CD11b, формирующими субпопуляции с различными фенотипами, активация которых приводит к сложным процессам элиминации патогена. Цель исследования - в созданной in vitro экспериментальной модели вирусно-бактериальной коинфекции уточнить варианты трансформации фенотипа субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов CD64-CD32+CD16+CD11b+НГ, СD64+CD32+CD16+CD11b+НГ и оценить возможность перепрограммирования их фенотипа под влиянием гексапептида аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозиларгинина (ГП). Проведено исследование 39 образцов периферической крови (ПК) условно здоровых взрослых добровольцев (7 женщин, 6 мужчин) в возрасте от 21 до 32 лет. Сформировано 3 группы: группа сравнения 1 (интактные НГ); группа сравнения 2 - модель вирусно-бактериальной инфекции; группа исследования - оценка влияния гексапептида аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинина (ГП). Для воспроизведения модели вирусно-бактериальной коинфекции образцы ПК инкубировали последовательно с ДцРНК (10-7М) в течение 60 мин, далее с fMLP (10-7М) в течение 60 мин 37 °С. Для оценки влияния ГП образцы ПК после преинкубации с ДцРНК и fMLP инкубировали с ГП (10-6 г/л) в течение 60 мин 37 °С. Проточной цитометрией (FC 500, Beckman Coulter, США) тестировалось количество НГ субпопуляций CD64-CD32+CD16+CD11b+НГ, CD64+CD32+CD16+CD11b+НГ и плотность экспресcии рецепторов (MFI) с использованием МКАТ (Beckman Coulter International S.A., Франция). Экспериментально выявлена трансформация фенотипа функционально значимых субпопуляций НГ CD64-CD32+CD16+CD11b+НГ, СD64+CD32+CD16+CD11b+НГ в модели вирусно-бактериального процесса в виде усиления экспрессии всех изучаемых рецепторов. Получены неоднозначные результаты влияния ГП на трансформированный в системе in vitro в модели вирусно-бактериальной коинфекции фенотип субпопуляций CD64-CD32+CD16+CD11b+НГ, СD64+CD32+CD16+CD11b+НГ, способствующие восстановлению адекватного ответа НГ.

Disruption of neutrophilic granulocyte (NG) functioning underlies one of the key causes for negative polymicrobial synergism during virus-microbial co-infections. In connection with this, it is important to develop experimental models for viral-bacterial co-infections in vitro, which might allow to uncover NG involvement in effector events and assess reorganization of inter-connected functionally relevant NG receptors in response to various immunotropic agents. Understanding molecular mechanisms related to any molecule including drug molecules provides its safe use allowing them to become drug of choice. NG functional activity is associated with surface receptors CD64, CD32, CD16, CD11b, which are assigned to several NG subsets exhibiting distinct phenotypes, and their activation leads to complex processes of pathogen elimination. Study objective: to elucidate types of phenotype transition for NG subsets CD64-CD32+CD16+CD11b+ and CD64+CD32+CD16+CD11b+ and assess an opportunity for phenotype reprogramming exposed to hexapeptide arginyl-alpha-aspartyl-lysyl-valyl-tyrosyl-arginine (HP) in experimental in vitro model of viral-bacterial coinfection. Materials and methods. We examined 39 samples of peripheral blood (PB) collected from healthy adult volunteers (7 women, 6 men) aged 21 to 32 years, subdivided into 3 groups: comparison group 1 (intact NG); comparison group 2 - model of viral-bacterial infection; Study group - to assess HP effects. Model of viral-bacterial co-infection was created by incubating PB samples sequentially with dsRNA (10-7M) for 60 min followed by fMLP (10-7M) for 60 min, 37 °C. To assess HP effect, PC samples preincubated with dsRNA and fMLP were next exposed to HP (10-6 g/L) for 60 min at 37 °C. We analyzed percentage of CD64-CD32+CD16+CD11b+ and CD64+CD32+CD16+CD11b+NG subsets as well as receptor expression density (MFI) by flow cytometry (FC 500, Beckman Coulter, USA) using MAbs (Beckman Coulter International SA, France). Results. Transformation of CD64-CD32+CD16+CD11b+ and CD64+CD32+CD16+CD11b+NG subset phenotype was experimentally revealed in virus-bacterial model manifested as upregulated expression of all receptors examined. Our data on HP effects ambiguously demonstrated phenotype transformation in CD64-CD32+CD16+CD11b+NG, CD64+CD32+CD16+CD11b+NG in in vitro viral - bacterial coinfection model contributing to recovery of proper NG response.