Ингибирование активности теломеразы при сверхэкспрессии апоптотической эндонуклеазы EndoG в cD4+-Т-клетках человека

Введение. Активность теломеразы регулируется альтернативным сплайсингом мРНК ее каталитической субъединицы hTERT (human Telomerase Reverse Transcriptase). Увеличение количества неактивного сплайс-варианта hTERTингибирует теломеразную активность. В настоящее время механизм сплайсинга hTERT изучен недостаточно. Известно влияние апоптоти-ческих эндонуклеаз на активность теломеразы. Цель работы. Изучение влияния апоптотической эндонуклеазы EndoG на альтернативный сплайсинг hTERT и активность теломеразы в нормальных Т-лимфоцитах человека. Материал и методы. CD4⁺-Т-лимфоциты человека трансфицировали плазмидой, содержащей ген EndoG pEndoG-GFP, или контрольной плазмидой pGFP Экспрессию генов EndoG и сплайс-вариантов hTERT проводили методом обратной транскрипции (ОТ) полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Содержание белка в клетках оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Активность теломеразы определяли по протоколу амплификации теломерных повторов. Результаты. Методом корреляционного анализа установлена взаимосвязь между уровнями экспрессии EndoG и сплайс-вариантов hTERT в CD4+- и CD8⁺-Т-лимфоцитах 12 здоровых доноров. Сверхэкспрессия EndoG в CD4⁺-Т-клетках вызывала снижение экспрессии полноразмерного активного варианта hTERT и увеличение экспрессии неактивного сплайс-варианта. Нарушение пропорции сплайс-вариантов hTERT в клетках приводило к значительному снижению теломеразной активности уже через 16 ч после трансфекции. Заключение. Показаны зависимость экспрессии апоптотической эндонуклеазы EndoG и сплайс-вариантов hTERT в Т-лимфоцитах человека, а также способность EndoG осуществлять альтернативный сплайсинг мРНК hTERT и снижать активность теломеразы в CD4⁺-Т-лимфоцитах человека.

Overexpression of apoptotic endonuclease endog inhibits telomerase activity in human CD4+ T cells

Introduction. Alternative splicing of telomerase catalytic subunit hTERT (human Telomerase Reverse Transcriptase) regulates the telomerase activity. The increased expression of non-active spliced hTERT results in inhibition of telomerase. However, very little is known about the mechanism of hTERT mRNA alternative splicing. Apoptotic endonucleases are known to participate in this process. The aim of the study was to determine the function of apoptotic endonuclease EndoG in the alternative splicing of hTERT and telomerase activity in normal human T lymphocytes. Methods. Human CD4+-T-lymphocytes were transfected with plasmid containing EndoG gene pEndogG-GFP or control plasmid pGFP. The expression of EndoG and hTERT splice-variants was determined by real-time RT-PCR. Intracellular protein amounts were analyzed by Western blotting. Telomeric repeat amplification protocol was used to measure telomerase activity. Results. Correlation analysis revealed the strong correlation between the expression of EndoG and hTERT splice-variants in CD4+- and СD8+Т-lymphocytes from 12 healthy donors. This correlation is more obvious in CD4+-T-cells. The overexpression of EndoG in CD4+-T-cells downregulated the expression of the active full-length hTERT variant and upregulated the non-active spliced variant. Reduction of full-length hTERT causes downregulation of telomerase activity 16 hours later transfection. Conclusion. In this work we demonstrated the correlation between the expression of EndoG and hTERT splice variants in human T lymphocytes. The EndoG overexpression results in alternative splicing of hTERT mRNA and downregulation of telomerase activity in CD4+Т cells