Количественная оценка содержания гистонов с помощью проточной цитометрии Htb2-GFP позволяющая легко отслеживать нарушения клеточного цикла в живых дрожжевых клетках, сравнимо со стандартным окрашиванием ДНК

Анализ изменений количества ДНК в отдельных клетках — хорошо зарекомендовавший себя метод изучения влияния различных возмущений на клеточный цикл. Недостатком этого метода является необходимость процедуры фиксации, которая не позволяет проводить исследования in vivo и одновременно контролировать дополнительные параметры, такие как флуоресценция меченых белков или генетически закодированные индикаторы. В этой работе мы сообщаем о методе количественной оценки содержания гистонов (HAQ) живых дрожжей, содержащих гистон, меченный GFP, Htb2. Мы показываем, что он предоставляет данные, в значительной степени соответствующие уровням ДНК как у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, так и у дрожжей Ogataea polymorpha. Протокол анализа содержания ДНК также был оптимизирован для использования с дрожжами Ogataea и Saccharomyces. Используя подход HAQ, мы демонстрируем ожидаемое влияние на развитие клеточного цикла для нескольких соединений и условий и демонстрируем возможность использования в сочетании с дополнительными флуорофорами. Таким образом, наши данные обеспечивают простой подход, который можно использовать в широком спектре исследований, в которых необходимо отслеживать влияние различных стимулов на клеточный цикл непосредственно в живых клетках.

Histone Abundance Quantification via Flow Cytometry of Htb2-GFP Allows Easy Monitoring of Cell Cycle Perturbations in Living Yeast Cells, Comparable to Standard DNA Staining

Assaying changes in the amount of DNA in single cells is a well-established method for studying the effects of various perturbations on the cell cycle. A drawback of this method is the need for a fixation procedure that does not allow for in vivo study nor simultaneous monitoring of additional parameters such as fluorescence of tagged proteins or genetically encoded indicators. In this work, we report on a method of Histone Abundance Quantification (HAQ) of live yeast harboring a GFP-tagged histone, Htb2. We show that it provides data highly congruent with DNA levels, both in Saccharomyces cerevisiae and Ogataea polymorpha yeasts. The protocol for the DNA content assay was also optimized to be suitable for both Ogataea and Saccharomyces yeasts. Using the HAQ approach, we demonstrate the expected effects on the cell cycle progression for several compounds and conditions and show usability in conjunction with additional fluorophores. Thus, our data provide a simple approach that can be utilized in a wide range of studies where the effects of various stimuli on the cell cycle need to be monitored directly in living cells.