ВЫЯВЛЕНИЕ ЗНАЧИМЫХ ДЛЯ ЭКСПОРТА ЗЕРНА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИОЗОВ И КОМПЛЕКСА СОПУТСТВУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОСЕВАХ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР (НА ПРИМЕРЕ ТИМИРЯЗЕВСКОЙ ПОЛЕВОЙ ОПЫТНОЙ СТАНЦИИ)

Согласно данным официальной статистики, в России ежегодно производится около 130 млн т продукции зерновых колосовых культур. В Едином Перечне карантинных объектов Евразийского экономического союза находится возбудитель желтого слизистого бактериоза пшеницы Rathayibacter tritici . Указанный вид подлежит выявлению при импорте и, при наличии требований импортера, при экспорте пшеницы. В связи с необходимостью регулирования в карантинных фитосанитарных лабораториях для Rathayibacter tritici имеется диагностическая методика. Для других возбудителей бактериозов зерновых культур, таких как Rathayibacter rathayi , Pseudomonas fuscovaginae , Pseudomonas cichorii, Pseudomonas fluorescens , Pseudomonas syringae, Acidovorax avenae, Erwinia rhapontici , Xanthomonas translucens , Clavibacter tessellarius и других, диагностические методики отсутствуют, поэтому обнаружения в практике работы диагностических фитосанитарных лабораторий не зафиксированы. Перечисленные виды регулируются странами-импортерами, закупающими в России более половины всей предназначенной для экспорта зерновой продукции. Бактериозы представляют серьезную угрозу производству зерна, а причиняемый ими возможный ущерб урожаю оценивается в 10-40 %. Бактерии могут вызывать вспышки заболеваний или находиться в растениях в скрытой форме в зависимости от условий окружающей среды и почти никогда не вызывают симптомов на зерне. В связи с этим обнаружить возбудителей бактериозов можно только в лаборатории, используя метод посева на питательные среды, проведение которого зачастую занимает неделю и более. Достоверная идентификация каждого вида бактерий, колонии которых получены в результате посева, возможна только с использованием молекулярных методов. Требуется разработка ПЦР-тестов, позволяющих проводить идентификацию целевых бактерий напрямую в образцах, не применяя культуральный метод, что существенно упростит и ускорит процедуру подтверждения соответствия состояния партий российского зерна требованиям импортеров. Разработка молекулярных методов диагностики возбудителей бактериозов зерновых культур возможна только после изучения их видового состава в растениях и зерне, при этом в вегетирующих растениях разнообразие живых бактерий существенно выше, чем в зерне. Информация о видовом составе бактерий на зерновых культурах позволит с применением геномного анализа обнаружить видоспецифичные ПЦР-мишени и разработать диагностические ПЦР-тесты для быстрой идентификации особо опасных и значимых для экспорта зерна видов бактерий. Ранее масштабного изучения бактериального состава в зерновых культурах не проводили, в связи с чем список бактерий, которые могут находиться вместе в одном образце, отсутствует. Отсутствует и полный перечень всех бактерий, которые можно встретить в зерновых культурах. В то же время для биоинформатического предсказания видоспецифичной ПЦР-мишени необходимо знать все виды, которые можно встретить в анализируемом образце, от которых следует отличать целевой вид. Состав бактериальной микробиоты может различаться в зависимости от культуры и сорта, поэтому максимальное разнообразие различных культур и сортов позволит получить более полную информацию. Влажные и умеренно теплые условия летнего периода в Центральном регионе России идеально подходят для развития бактериозов, поэтому сбор образцов мы проводили на территории Тимирязевской полевой опытной станции (г. Москва), где ежегодно ведутся работы по гибридизации, селекции и сортоиспытанию нескольких сотен сортов зерновых культур. Работа посвящена выявлению и идентификации бактерий в образцах зерновых культур Тимирязевской полевой опытной станции (г. Москва). Объектами исследования были бактериальные изоляты, выделенные из образцов зерновых культур в 2020 году. Идентификацию бактерий проводили посредством секвенирования ампликонов, полученных в результате ПЦР с парами праймеров PSF/PSR, SyD1/SyD2 и 8UA/519B и сравнения полученных последовательностей с помощью сервиса BLAST с последовательностями, размещенными в GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). В результате собраны 55 образцов зерновых культур, выделен и идентифицирован 171 бактериальный изолят, в том числе до вида идентифицированы 34 изолята. Бактериальное разнообразие представлено 14 видами. Среди них - фитопатогены Pantoea ananatis , Clavibacter michiganensis , Rhodococcus fascians , Pseudomonas trivialis , Pseudomonas viridiflava и Pseudomonas syringae . Наибольшая частота встречаемости - 70,9 % отмечена у видов, относящихся к роду Pseudomonas . Также высокой частотой встречаемости характеризуются представители родов Frigoribacterium (36,4 %), Clavibacter (16,4 %), Arthrobacter (12,7 %) и Rhodococcus (10,9 %). Результаты проведенного исследования могут быть использованы при разработке быстрых и достоверных способов диагностики особо опасных и значимых для экспорта зерна видов бактерий. Кроме того, в процессе исследования выделены бактерии, принадлежащие определенным родам, но не относящиеся ни к одному из известных видов, что делает их перспективными для дальнейшего изучения и возможности описания новых видов - представителей микробиоты зерновых культур.

According to official statistics, about 130 million tons of cereals are produced annually in Russia. In the Unified List of quarantine objects of the Eurasian Economic Union is the causative agent of wheat yellow mucous bacteriosis Rathayibacter tritici . This species is subject to detection during import and, if the importer requires, during export of wheat. Due to the need for regulation, there is a diagnostic method for Rathayibacter tritici in quarantine phytosanitary laboratories. For other pathogens of bacteriosis in grain crops, such as Rathayibacter rathayi , Pseudomonas fuscovaginae , Pseudomonas cichorii , Pseudomonas fluorescens , Pseudomonas syringae, Acidovorax avenae, E rwinia rhapontici , Xanthomonas translucens , Clavibacter tessellarius , etc., there are no diagnostic methods, due to which no detections have been recorded in the practice of diagnostic phytosanitary laboratories. The listed types are regulated by importing countries that purchase more than half of all grain products intended for export in Russia. Bacterioses pose a serious threat to grain production, and the possible damage they cause to the crop is estimated at 10-40 %. The bacteria can cause disease outbreaks or be latent in plants depending on environmental conditions and almost never cause symptoms on grain. In this regard, it is possible to detect causative agents of bacteriosis only in the laboratory using the method of inoculation on nutrient media, which often takes a week or more. Reliable identification of each type of bacteria is possible only with the use of molecular methods. It is required to develop PCR tests that allow the identification of target bacteria directly in samples without using the cultural method, which will significantly simplify and speed up the procedure for confirming the compliance of the state of Russian grain batches with the requirements of importers. The development of molecular methods for diagnosing causative agents of bacterioses in grain crops is possible only after studying their species composition in plants and grain, while the diversity of living bacteria in vegetative plants is significantly higher than in grain. Information on the species composition of bacteria on grain crops will make it possible, using genomic analysis, to detect species-specific PCR targets and develop diagnostic PCR tests for the rapid identification of bacterial species that are especially dangerous and important for grain export. Previously, a large-scale study of the bacterial composition in grain crops was not carried out, and therefore, there is no list of bacteria that can be found together in one sample. There is also no complete list of all bacteria that can be found in cereals. At the same time, for bioinformatic prediction of a species-specific PCR target, it is necessary to know all the species that can be found in the analyzed sample, from which the target species should be distinguished. The composition of the bacterial microbiota may differ depending on the crop and variety, so the maximum diversity of different crops and varieties will provide more complete information. Humid and moderately warm summer conditions in the Central region are ideal for the development of bacteriosis. In connection with the foregoing, sampling was carried out on the territory of the Timiryazevskaya field experimental station (Moscow), where hybridization, selection and variety testing of several hundred varieties of grain crops are carried out annually. The work is devoted to the detection and identification of bacteria in samples of grain crops of the Timiryazevskaya field experimental station (Moscow). The objects of the study were bacterial isolates from grain samples in 2020. Bacteria were identified by sequencing the amplicons obtained by PCR with primer pairs PSF/PSR, SyD1/SyD2, and 8UA/519B and comparing the resulting sequences using the BLAST service with sequences posted in GenBank (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov). As a result, 55 samples of grain crops were collected, 171 bacterial isolates were isolated and identified, including 34 isolates identified to species. Bacterial diversity is represented by 14 species. Among them, there are phytopathogens Pantoea ananatis , Clavibacter michiganensis , Rhodococcus fascians , Pseudomonas trivialis , Pseudomonas viridiflava and Pseudomonas syringae. The highest frequency of occurrence, 70.9 %, was noted in species belonging to the genus Pseudomonas . Representatives of the genera Frigoribacterium (36.4 %), Clavibacter (16.4 %), Arthrobacter (12.7 %) and Rhodococcus (10.9%) also have a high frequency of occurrence. The results of the study can be used in the development of fast and reliable methods for diagnosing especially dangerous and important bacterial species for grain export. In addition, during the study, bacteria were isolated that belong to certain genera, but do not belong to any of the known species, which makes them promising for further study to describe new species in the microbiota of grain crops.