Epigenetic effects of enzastaurin - a new aspect in the mechanism of action of an anticancer drug from protein kinase inhibitors

The purpose of the study was to analyze the ability of five antitumor drugs from the pharmaceutical group of protein kinase inhibitors (gefitinib, imatinib, pazopanib, ponatinib and enzastaurin) to reactivate the expression of the epigenetically silenced GFP in HeLa TI cells, and to estimate the effect of epigenetically active drugs on: 1) acetylation and methylation of histones H3 and H4; 2) integral DNA methylation; 3) activity of HAT and HDAC1 enzymes; 4) expression levels of the genes encoding epigenetic regulation enzymes (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B; SIRT1, HDAC1; SETD1A, SETD1B, SUV420H1, SUV420H2, SUV39H1, SUV39H2). Material and Methods. The epigenetic activity of antitumor drugs was determined using the HeLa TI test system, a population of HeLa cells with the retroviral vector containing the epigenetically silenced GFP. The level of integral DNA methylation was analyzed using MspI/HpaII methyl-sensitive restriction analysis. Histone modifications were analyzed by Western blotting with antibodies to acetylated and methylated histones H3 and H4. The total activity of HAT enzymes was analyzed using Histone Acetyltransferase Activity Assay Kit. Expression of the epigenetic enzyme genes was analyzed using real-time quantitative RT-PCR. Results. It was shown that only the enzyme inhibitor Cp protein kinase enzastaurin had the ability to reactivate the expression of epigenetically silenced GFP in the HeLa TI cells. We showed that under the action of enzastaurin, the level of integral DNA methylation and expression of DNMT3A and DNMT3B DNA methyltransferase genes decreased. It was also found that enzastaurin reduced the expression levels of histone deacetylases HDAC1 and SIRT1, but did not affect the activity and expression levels of histone acetylases, the level of histone methylation (H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3, H4K20me3), and the level of expression of the histone methyltransferases (SUV39H1, SUV39H2, SUV420H1, SUV420H2, SETD1A и SETD1B). Conclusion. The data obtained are important for clarifying the mechanisms of action of 5 protein kinase inhibitors, in particular with respect to enzastaurin, the protein kinase Cp inhibitor, for which the ability to reactivate epigenetically silent genes due to the effect on DNA methylation and histone acetylation was demonstrated.

Цель исследования - провести анализ способности 5 противоопухолевых препаратов из фармакологической группы ингибиторов протеинкиназ (гефитиниб, иматиниб, пазопаниб, понатиниб и энзастаурин) реактивировать экспрессию эпигенетически репрессированного гена GFP в клетках HeLa TI, а также изучить влияние препаратов, обладающих реактивирующим эффектом, на: 1) ацетилирование и метилирование гистонов Н3 и Н4; 2) интегральное метилирование ДНК; 3) активность ферментов HAT и HDAC1; 4) уровень экспрессии генов, кодирующих ферменты эпигенетической регуляции (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B; SIRT1, HDAC1; SETD1A, SETD1B, SUV420H1, SUV420H2, SUV39H1, SUV39H2). Материал и методы. Скрининг эпигенетической активности противоопухолевых препаратов осуществляли с помощью тест-системы HeLa TI - популяции клеток HeLa с интегрированным ретровирусным вектором, содержащим эпигенетически репрессированный ген GFP. Изменение уровня интегрального метилирования ДНК анализировали с помощью метил-чувствительного рестрикционного анализа MspI/ HpaII. Изменение уровня гистоновых модификаций анализировали методом Вестерн-блоттинг с антителами к ацетилированным и метилированным сайтам гистонов Н3 и Н4. Анализ тотальной активности ферментов семейства НАТ проводили при использовании набора реактивов для определения активности гистоновых ацетилтрансфераз. Анализ экспрессии генов эпигенетических регуляторных ферментов осуществляли с помощью метода количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Результаты. Показано, что среди исследуемых препаратов способностью реактивировать экспрессию эпигенетически репрессированного гена GFP в популяции HeLa TI обладает только ингибитор протеинкиназы Ср энзастаурин. Мы продемонстрировали, что при действии энзастаурина происходит снижение уровня интегрального метилирования ДНК и экспрессии генов ДНК-метилтрансфераз DNMT3A и DNMT3B. Также установлено, что энзастаурин снижает уровень экспрессии гистоновых деацетилаз HDAC1 и SIRT1, но не влияет на активность и уровни экспрессии гистоновых ацетилаз, уровень метилирования гистонов (H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3, H4K20me3) и уровень экспрессии гистоновых метилтрансфераз (SUV39H1, SUV39H2, SUV420H1, SUV420H2, SETD1A и SETD1B). Заключение. Полученные данные важны в плане уточнения механизмов действия 5 противоопухолевых препаратов группы ингибиторов протеинкиназ, в особенности в отношении ингибитора протеинкиназы Cp энзастаурина, для которого была продемонстрирована способность реактивировать экспрессию эпигенетически молчащих генов за счет влияния на механизмы метилирования ДНК и ацетилирования гистонов.

Авторы
Maksimova V.P.1 , Makus J.V.2 , Usalka O.G.3 , Lylova E.S.1 , Bugaeva P.E.3 , Zhidkova E.M.1 , Fedorov D.A.3 , Lizogub O.P.3 , Lesovaya E.A.1, 4 , Belitsky G.A. 1 , Yakubovskaya M.G. 1 , Kirsanov K.I. 1, 5
Редакторы
-
Издательство
Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences
Номер выпуска
4
Язык
Английский
Страницы
67-78
Статус
Опубликовано
Подразделение
-
Ссылка
-
DOI
-
Номер
-
Том
19
Год
2020
Организации
  • 1 N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology
  • 2 MIREA - Russian Technological University
  • 3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)
  • 4 I.P. Pavlov Ryazan State Medical University
  • 5 RUDN University
Ключевые слова
protein kinase inhibitors; enzastaurin; epigenetic activity; HeLa TI; histone modifications; DNA methylation; hat; Hdac; ингибиторы протеинкиназ; энзастаурин; эпигенетическая активность; гистоновые модификации; метилирование ДНК
Дата создания
02.11.2020
Дата изменения
02.11.2020
Постоянная ссылка
https://repository.rudn.ru/ru/records/article/record/67954/